UVOD

Pneumonija ostaje važan faktor morbiditeta i mortaliteta: u razvijenim zeljama pneumonija je odgovorna za oko 90%, a u zemljama u razvoju za oko 50% smrtnih slučajeva usled infektivnih oboljenja (1). Krajem dvadesetog veka mortalitet od pneumonije u mlađih od 65 godina bio je jednak ukupnom mortalitetu od svih drugih zaraznih bolesti u Engleskoj i Velsu, a pneumonija je bila uzrok smrti u približno 90% umrlih od zaraznih bolesti (2). U Velikoj Britaniji, 95% svih smrtnih slučajeva od pneumonije (25 000 obolelih ) je u grupi starijih od 65 godina. U SAD od pneumonije godišnje oboli 4 miliona ljudi, milion se mora lečiti bolnički, a bar 60 000 umire (4,5). Bez obzira na razvoj medicine i otkrivanje novih, efikasnijih i specifičnijih antibiotika i hemioterapeutika , uz poboljšanje nege, mortalitet je između 1982. i 1990. godine porastao sa 10.9% na 14%, što se ne može objasniti samo demografskim činiocima (starenje populacije , više hroničnih oboljenja, itd ) i komorbiditetom (6). Za našu zemlju nema raspoloživih podataka novijeg datuma (7.8,9).

Osnovni problem u tretiranju pneumonije je pravovremena identifikacija uzročnika, koja je preduslov za blagovremenu i adekvatnu terapiju .

Etiološka dijagnoza pneumonija se postavi u manje od 45% slučajeva , s obzirom na nedostatak standardizovane rutinske metodologije dobijanja valjanog biološkog materijala , čak i u kliničkim uslovima (10,11). Ovo može imati različite posledice, počev od dugotrajnijeg i skupljeg lečenja, jer se ne zna uzročnik niti njegova osetljivost na antibiotike, pa sve do smrtnog ishoda, jer se ne može primeniti adekvatna terapija kojom bi se izbegle komplikacije.

Zato smo odlučili da ispitamo kliničku validnost uzoraka dobijenih rutinskim dijagnostičkim postupcima raspoloživim u svakoj specijalizovanoj pulmološkoj ustanovi: sputuma (12,13,14, hemokulture (15), punktata pleure, sadržaja iglene aspiracijske biopsije pluća (16,17), uzoraka koji se dobijaju pomoću fiberoptičkog bronhoskopa: bronhoaspirat, bris bronha zaštićenom četkicom (“braš”), transbronhijalna biopsija i bronhoalveolni lavat (BAL) (18,19).

BOLESNICI I METODE

U istraživanje su uključena 43 bolesnika sa pneumonijom, životne dobi 18 godina i više, lečenih u različitim klinikama Vojnomedicinske akademije  i u Klinici za internu medicinu KBC Bežanijska Kosa. Kriterijumi za uključivanje u istraživanje bili su: anamnestički podaci, klinički i radiografski nalaz koji ukazuju na pneumoniju, kao i sledeći laboratorijski parametri (određeni na osnovu gornjih granica referentnih vrednosti lokalne laboratorije): brzina sedimentacije eritrocita preko 20 mm u prvom satu, broj leukocita preko 8x10⁹/l ili neutrofilija u diferencijalnoj leukocitnoj formuli preko 7.5x10⁹/ml, serumska koncentracija fibrinogena preko 4.0 g/l i C-reaktivnog proteina preko 12 mg/l. Bolesnici koji su zadovoljili bar dva od navedenih laboratorijskih kriterijuma ispitivani su dalje. U studiju su odabirani bolesnici sa nelečenom pneumonijom, ali iz praktičnih razloga nisu isključivani ni oni kojima je otpočeta antibiotska terapija.

Ispitanici su bili sami sebi kontrolna grupa, jer su kao sigurni uzorci smatrani oni dobijeni venepunkcijom, punkcijom pleure i perkutanom transtoraksnom aspiracijom iglom iz predela lezije. Ispitivan je dijagnostički značaj uzoraka dobijenih pomoću fiberoptičkog bronhoskopa, kao i klasičnih uzoraka, rutinski korišćenih u dijagnostici respiracijskih infekcija (sputum).

Da bi se utvrdio stepen kontaminacije pri radu bronhoskopom, u ispitivanje je uključeno i 10 bolesnika u kojih je sa sigurnošću isključena pneumonija, kao i sva druga infektivna oboljenja: 8 obolelih od sarkoidoze, jedna bolesnica sa kombinovanom sistemskom bolešću veziva i jedna sa solitarnom metastazom adenokarcinoma u plućima. U ovih bolesnika bronhoskopija je rađena radi dijagnostike i procene aktivnosti osnovne bolesti, i tom prilikom uzimani su isti endoskopski uzorci kao u ispitanika sa pneumonijom. Pregled sputuma, torakocenteza, perkutana iglena aspiracija i hemokultura nisu rađeni, jer nije postojala indikacija.

Uz prethodnu saglasnost bolesnika, pre uvođenja terapije vršena je bronhoskopija fiberoptičkim instrumentom proizvođača Olympus, tipa BF1T10 ili BF1T20D, ili proizvođača Pentax, tipa FB 18X ili FB19TX. Instrument je uvođen kroz nos, nakon lokalne anestezije nosnih kanala 2% gelom lidokain hlorida, i usne duplje i glasnica 10% rastvorom lidokain hlorida u obliku aerosola, pazeći da se ne aspirira sadržaj gornjih disajnih puteva. Pošto je vrh bronhoskopa prošao između glasnica, instiliran je 2% rastvor lidokain hlorida kroz radni kanal instrumenta, u ukupnoj količini manjoj od 3 ml, da bi se izbegao bakteriostatski učinak anestetika. Vrh instrumenta usmeravan je i zaglavljivan u bronh obolelog režnja ili segmenta, odnosno onaj iz kojeg je navirala najobilnija sekrecija. Prvo je rađeno četkanje zaštićenom četkicom, koja se potom uranjala u transportnu podlogu (tečna podloga sa kuvanim mesom). Nakon toga je vršena bronhoalveolna lavaža sa po 2 alikvota od po 50 ml toplog (37⁰C) 0.9% rastvora NaCl. Na kraju je vršena aspiracija vidljivog sekreta u bronhijalnom stablu, koji je sakupljan u posebnoj posudi i zatim na tečnoj transportnoj podlozi upućivan na bakteriološki pregled. U 15 bolesnika učinjena je transbronhijalna biopsija malim kleštima i po jedan isečak upućen u tečnoj transportnoj podlozi (kuvano meso) na bakteriološki pregled.

U 16 bolesnika učinjena je i perkutana transtoraksna aspiracija iglom iz predela pneumonične lezije (pod radioskopskom kontrolom). Aspiracija je rađena u sterilnim uslovima dugom tankom iglom (promera do 18G), pošto je prethodno izvršena klasična hirurška priprema polja koje je punktirano. Dobijeni aspirat odmah je inokulisan u tečnu hranljivu podlogu (kuvano meso) i upućivan na bakteriološki pregled.

Od svih poslatih materijala spravljani su mikroskopski preparati i bojeni po Gramu. Rezultat pregleda ovih preparata javljan je odmah lekaru radi inicijalne orijentacije, do dobijanja definitivnog nalaza izolata bakterije i testa osetljivosti (antibiogram). Kod sputuma, rađen je i citološki pregled preparata bojenog po Giemsi, kao orijentacija da li je uzorak reprezentativan za donje disajne puteve. Ukoliko nije zadovoljavao Mayo kriterijume (20), uzorak nije bakteriološki obrađivan.

Dalje je preostali materijal zasejavan na krvni agar za aerobe, krvni agar za anaerobe (hemin i K vitamin) i tečnu podlogu sa kuvanim mesom. Inkubacija za aerobe vršena je u termostatu na 37⁰C u toku 24 časa, a za anaerobe u komori Heraeus pod anaerobnim uslovima tokom 48 sati. Identifikacija je vršena standardnim mikrobiološkim metodama za aerobe i na API-20 A (BioMerieux, France) sistemu za anaerobe.

Broj bakterija je određivan semikvantitativnom metodom, imajući u vidu diluciju pojedinih bioloških materijala:

• za uzorke dobijene četkanjem sluznice bronha zaštićenom četkicom ("braš") faktor dilucije izračunavan je na osnovu poznate činjenice da uzorak uzet četkicom ima zapreminu približno 10^-3 ml, da se razređuje u 10 ml transportne podloge i da se potom zasejava ezom zapremine 5x10^-3 ml. Tako izračunat, faktor dilucije za braš iznosi 2x10⁶.

• za materijal dobijen BAL-om dilucija je oko 10^-2, a zasejava se takođe ezom zapremine 5x10^-3 ml, što znači da faktor dilucije za BAL iznosi 2x10⁵.
• za aspirat koji se sipa u 10 ml transportne podloge i zasejava pomenutom ezom, faktor dilucije za aspirat bronha iznosi 2x10⁴.

Ako se kao granična vrednost za patogenetski značaj izolata iz bronhoskopskih uzoraka uzme njihovo prisustvo u broju većem od 10⁴ jedinica koje formiraju koloniju (colony-forming unit, cfu) u jednom mililitru (21), svi izolati iz ovih uzoraka se mogu okvalifikovati kao potencijalni patogeni.

Međutim, da bi se isključila greška usled masivne kontaminacije uzoraka bakterijskom florom usne duplje, kao dodatni faktor sigurnosti određeno je da se kao potencijalni uzročnik pneumonije u naših ispitanika smatra bakterija koja se nađe u najmanje dva različita uzorka (od kojih jedan endoskopski) ili tri endoskopska uzorka. Drugi mikroorganizmi okarakterisani su kao kontaminanti.

Pouzdanost dijagnostičkih procedura koje su ispitivane u ovom radu procenjivana je na osnovu statističke metodologije koja se koristi u epidemiologiji. Sve pojave određenih bakterija u dobijenim uzorcima biološkog materijala klasifikovane su kao stvarno pozitivne (izolovana bakterija shvaćena kao uzročnik pneumonije), lažno pozitivne (izolovana bakterija shvaćena kao kontaminant), stvarno negativne (uzorak sterilan u pacijenata kontrolne grupe bez pneumonije) i lažno negativne (biološki materijal ostao sterilan iako je pacijent imao dokazanu pneumoniju). Određivani su sledeći pokazatelji pouzdanosti: osetljivost (verovatnoća da se među izolovanim bakterijama u uzorcima dobijenim tom procedurom nađe uzročnik pneumonije), specifičnost (pokazatelj verovatnoće kontaminacije uzorka bakterijama koje ne mogu biti shvaćene kao uzročnik pneumonije), pozitivna (pokazatelj verovatnoće izolovanja uzročnika iz uzorka dobijenog odgovarajućom procedurom u obolelih od pneumonije) i negativna prediktivna vrednost svake dijagnostičke procedure (pokazatelj verovatnoće da uzorci dobijeni nekom dijagnostičkom procedurom u kontrolnoj grupi bolesnika bez pneumonije ostanu sterilni).

REZULTATI

U kontrolnoj grupi (pacijenti bez znakova infekcije donjih disajnih puteva) nađeno je 32 izolata u uzorcima koji bi po definiciji trebalo da budu sterilni: u BAL-u 13 izolata, brašu 9, aspiratu bronha 10, dok je svih 8 uzetih uzoraka transbronhijalne biopsije pluća (TBB) ostalo sterilno (Tabela 1).

U grupi od 43 ispitanika obolelih od pneumonije dobijeno je ukupno 367 izolata, od kojih su 162 shvaćeni na osnovu korelacije sa kliničko-laboratorijskim podacima kao uzročnici pneumonije, dok je 205 izolata shvaćeno kao kontaminanti (Tabela 2).

U Tabeli 3 prikazana je učestalost pojedinih bakterija kao uzročnika pneumonije, bilo kao jedinog ili u sklopu udružene infekcije, dok je struktura uzročnika prema životnoj dobi obolelih prikazana u Tabeli 4.

Tabela 4. Uzročnici pneumonije prema životnoj dobi pacijenata

Bakterija uzročnik pneumonije	<65 god. n (%)	65 god. i stariji n (%)
Streptococcus pneumoniae	14 (33%)	0
Str. pyogenes	4 (10%)	0
Str. beta-haemolyticus gr. B	0	1(10%)
Staphylococcus aureus	10 (24%)	1(10%)
koagulaza negativni stafilokok	1 (2%)	3 (30%)
Enterococcus spp.	3 (7%)	1 (10%)
Str. viridans	2 (5%)	1 (10%)
Klebsiella pneumoniae	4 (10%)	1 (10%)
Pseudomonas spp.	2 (5%)	2 (20%)
Haemophilus influenzae	1 (2%)	0
Escherichia coli	1 (2%)	0

U Tabeli 5. prikazana je struktura - kvalitet nalaza (stvarno i lažno pozitivnih, odnosno negativnih) prema vrstama uzoraka, u Tabeli 6. vidi se njihov dijagnostički doprinos a u Tabeli 7. njihova pouzdanost.

DISKUSIJA I ZAKLJUČCI

Uzročnik bakterijske infekcije može se izolovati iz uzoraka biološkog materijala dobijenih endoskopskim postupcima primenjenim pre početka lečenja pneumonije.

Kontaminacija instrumenta pri prolasku kroz gornje disajne puteve je neminovna. Zato je pouzdanost pojedinih uzoraka dobijenih endoskopskim putem različita. Aspirat bronha ima osetljivost 100% ali specifičnost mu je svega 10%. Uzorak dobijen četkanjem "zaštićenom" četkicom ima osetljivost 97% ali specifičnost je svega 9%. Transbronhijalna biopsija ima osetljivost 100% a specifičnost 35%. Bronhoalveolna lavaža ima takođe osetljivost 100%, ali je specifičnost vrlo niska (8%) i pokazala se neadekvatnom za rutinsku primenu.

Izolovani mikroorganizmi ne smeju se prihvatiti a priori kao uzročnici pneumonije, već se mora sagledati pacijent kao celina, sa svim predisponirajućim faktorima za razvoj oboljenja i nalaz određenog mikroorganizma. Na osnovu poznatog faktora dilucije, a imajući u vidu da se u našoj studiji BAL pokazao najpogodnijim od svih bioloških materijala, kao moguć uzročnik pneumonije prihvata se izolovani mikroorganizam čija koncentracija u uzorku biološkog materijala (BAL) iznosi preko 2x10⁵ kolonija/ml, a poželjno je da ovaj mikroorganizam bude izolovan i iz još nekog uzorka (TBB, braš).

Dragocen doprinos daje citološki skrining kojim se eliminišu nereprezentativni uzorci, kao i bojenje po Gramu, jer je ponekad teško kultivisati bakteriju koja je već tretirana antibioticima ili vrlo zahtevna pri kultivaciji.

Zbog neizbežne kontaminacije instrumenta i uzoraka pri prolazu kroz gornje disajne puteve i velikog procenta lažno pozitivnih nalaza, endoskopom dobijeni uzorci ne mogu se smatrati apsolutno pouzdanim za izolaciju uzročnog mikroorganizma kod bakterijskih pneumonija.

Imajući u vidu relativnu agresivnost endoskopske tehnike i ograničenja u pogledu pouzdanosti dobijenih uzoraka, ova se tehnika ne bi mogla preporučiti za rutinsku kliničku praksu u etiološkoj dijagnostici pneumonija.

Endoskopijom dobijeni uzorci mogu se koristiti samo u određenim okolnostima, kada pacijent ne reaguje na empirijsku terapiju pa se traži uzročnik rezistentan na primenjene antibiotike, ili kada se radi o životno ugroženom pacijentu i kada je utvrđivanje osetljivosti uzročnika na antibiotike važnije od njegove identifikacije. Takođe, dolazi u obzir primena ovih uzoraka ukoliko se pacijentu iz drugih razloga radi bronhoskopija.

Savremena tehnologija omogućila je da se na tržištu pojave specijalne zaštićene četkice i kateteri za aspiraciju bronhijalnog sekreta, čiji proizvođači tvrde da se njihovom primenom može izbeći kontaminacija iz gornjih disajnih puteva. Time bi glavni nedostatak endoskopskog uzimanja bakterioloških uzoraka iz donjih disajnih puteva bio otklonjen.

Sputum, pravilno uzet, ostaje uzorak u kojem se najbrže, i sa dovoljnom pouzdanošću, mogu otkriti najčešći uzročnici pneumonije, pod uslovom da se citološkim skriningom eliminišu nereprezentativni uzorci, a bojenjem po Gramu dobije dragocena orijentacija za izbor inicijalne antibiotske terapije.